我國(guó)首例非洲豬瘟的確診

王清華 1，任煒杰 1，包靜月 1，戈勝?gòu)?qiáng) 1，李金明 1，李 林 1，樊曉旭 1，劉春菊 1，王 華 1，永強(qiáng) 1，徐天剛 1，吳曉東 1，段亞良 2，顧貴波 2，周晨陽(yáng) 2

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心，山東青島 266032；2. 遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164）

摘 要 ：近日，遼寧省沈陽(yáng)市一養(yǎng)豬戶(hù)飼養(yǎng)的豬陸續(xù)發(fā)生不明原因死亡，病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染。經(jīng)國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心檢測(cè)，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性，B646L/p72 基因序列417 個(gè)堿基與俄羅斯毒株 100% 匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬于同一進(jìn)化分支。這是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的首例非洲豬瘟，疫情來(lái)源有待進(jìn)一步調(diào)查。關(guān)鍵詞 ：非洲豬瘟 ；非洲豬瘟病毒 ；熒光定量 PCR ；普通 PCR ；ASFV 特異性抗體中圖分類(lèi)號(hào) ：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ：A

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病， 臨床上以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達(dá) 100%。鑒于該病的嚴(yán)重危害性，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。ASFV 不感染人，對(duì)人的健康不構(gòu)成威脅。目前， 針對(duì) ASF 防控，尚無(wú)有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心接到遼寧省沈陽(yáng)市沈北區(qū)發(fā)現(xiàn) ASF 臨床可疑病例的報(bào)告（圖 1）。截至 8 月 1 日，發(fā)病豬場(chǎng)累計(jì)死亡 47 頭，對(duì)剛病死的 2 頭豬剖檢發(fā)現(xiàn)：脾臟極度腫大，嚴(yán)重梗死，質(zhì)脆易碎，其中一頭豬脾腫大至少 10 倍，一頭豬脾腫大 5~7 倍；肺出血、質(zhì)硬，有間質(zhì)性肺炎變化；下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)出血，切面呈大理石樣變；胃漿膜面彌漫性出血；腎腫脹明顯、色淡，未見(jiàn)出血點(diǎn)；扁桃體見(jiàn)陳舊性出血，符合 ASF 癥狀。國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心立即開(kāi)展病原學(xué)檢測(cè)，證實(shí)本次疫情由ASFV 引起。這是我國(guó)歷史上的首次 ASF 發(fā)病記錄。

圖 1 發(fā)病場(chǎng)地理位置

1 材料與方法

1.1 病料

病原學(xué)樣品：分別來(lái)源于 2 頭病死豬的剖檢病料，包括全血、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體；30 頭臨床健康豬的全血。

血清樣品：2 頭病死豬及同群 30 頭臨床健康豬血清。

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的組織勻漿管（Roche）中，加入600 μL PBS 緩沖液，再加入剪碎的組織樣品約 30mg，使用 HyBaid RiboLyser 組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理。取 200 μL 組織勻漿液和全血，分別使用病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA。最后將提取的核酸于 ?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.3 熒光定量 PCR

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 [1]，用本實(shí)驗(yàn)室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的熒光定量 PCR 方法進(jìn)行 ASFVp72 基因片段的擴(kuò)增。ASFV 特異性引物為 king-s/ king-a，TaqMan 探針為 ASFVP，同時(shí)以本試驗(yàn)室合成的質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 普通 PCR

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 [2]，用本實(shí)驗(yàn)室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的 PCR 方法進(jìn)行 ASFV p72 基因片段的擴(kuò)增。ASFV 特異性引物為 PPA1/PPA2，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 257 bp，同時(shí)以本試驗(yàn)室合成的質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 測(cè)序片段 PCR 擴(kuò)增

依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 [3-4]，合成擴(kuò)增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用高保真的Phusion High- Fidelity PCR Master Mix 擴(kuò)增B646L/p72 基因片段， 預(yù)期擴(kuò)增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反應(yīng)體系 為 ：2X Phusion Master Mix 25 μL，p72-D（10μmol/L） 和 p72-U（10 μmol/L） 各 2 μL， 模 板DNA 2 μL，用滅菌水補(bǔ)齊體積至 50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 30 s；然后進(jìn)行 35 個(gè) PCR 循環(huán)（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72℃ 10 min。

1.6 PCR 產(chǎn)物測(cè)定

擴(kuò)增產(chǎn)物使用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收， 對(duì)回收的 DNA 直接用于測(cè)序。序列 拼 接 采 用 Lasergene 7.1 軟 件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA） 中 的 EditSeq 與 MegAlign 模塊。多序列的比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制，應(yīng)用MEGA 5.0 軟件進(jìn)行。其他國(guó)家的參考毒株序列從GenBank 中獲得。

1.7 抗體檢測(cè)

西班牙 INGENASA 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟阻斷 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為 050218。法國(guó)ID-vet 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟間接 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)為 B71。國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心自主研發(fā)的非洲豬瘟間接 ELISA 試劑盒，批號(hào)為 201801。INGENASA 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟阻斷ELISA 試劑盒包被抗原為 p72 蛋白，IDvet 公司生產(chǎn)的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為p30、p62、p72 重組蛋白， 自主研發(fā)的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為 p30 蛋白。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量 PCR

熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，采自 2 只病死豬的 8 份組織樣品和全血中都能檢測(cè)到ASFV 特異性擴(kuò)增曲線，Ct 值為 19.14~26.5（圖 2）。

圖 2 實(shí)時(shí)定量 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增曲線的橫坐標(biāo)為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；綠色橫線位置為熒光強(qiáng)度的閾值，對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為臨界循環(huán)數(shù)（CT）；CT 值低于 40 判定為陽(yáng)性；圖中擴(kuò)增曲線從左至右依次為P、全血 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 2

2.2普通 PCR

ASFV 普通PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，7 個(gè)樣本（分別為全血 1、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2）在 257 bp 左右有特異性擴(kuò)增條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致（圖 3）。樣本脾 2 特異性擴(kuò)增條帶較弱。

圖 3 普通 PCR 檢測(cè)結(jié)果

1~8. 全血 1、淋巴結(jié) 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結(jié) 2、腎 2、脾2；P. 陽(yáng)性對(duì)照；N. 陰性對(duì)照；M. 分子量標(biāo)記（由上至下分別為2000、1000、750、500、250、100 bp

2.3 p72 基因片段序列遺傳進(jìn)化分析

對(duì)樣本 B646L/p72 基因片段普通 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序，對(duì)得到的序列進(jìn)行拼接后獲得 p72基因片斷序列，長(zhǎng)度為 417 bp（圖 4）。對(duì)擴(kuò)增的P72 基因序列，應(yīng)用鄰接法（Neighbor-joining）繪制了遺傳發(fā)生樹(shù)（圖 5）。結(jié)果顯示，該樣本病毒屬于基因 II 型，與目前在俄羅斯和東歐流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）同屬于一個(gè)進(jìn)化分支。

2.4 抗體檢測(cè)

對(duì) 32 份血清樣品的 ASFV 特異性抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

圖 4 樣本 p72 基因片段測(cè)序結(jié)果

圖 5 P72 基因遺傳進(jìn)化分析

3 討論

ASFV 是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲豬瘟病毒屬的唯一成員， 基因組為雙股線狀DNA，大小為 170~190 kb。根據(jù)病毒編碼主要衣殼蛋白 p72 的 B646L 基因，可將該病分為 24 個(gè)與地域性相關(guān)的基因型 [5-6]?；?II 型流行于非洲東南部，2007 年傳至格魯吉亞，并擴(kuò)散到俄羅斯聯(lián)邦和東歐地區(qū) [7]，已在高加索地區(qū)定殖；2017 年，該基因型病毒向東長(zhǎng)距離跨越式傳播至俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伊爾庫(kù)茨克 [9]，導(dǎo)致傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)空前升高。目前，ASF 已經(jīng)成為困擾歐洲養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重要問(wèn)題 [8]。該病跨國(guó)界傳播能力和危害性使其成為全球性的問(wèn)題。

本次疫情是我國(guó)確診的首例非洲豬瘟。該豬場(chǎng)生物安全條件較差，緊臨車(chē)輛繁忙的鄉(xiāng)間公路， 場(chǎng)區(qū)出入口無(wú)消毒池。病死豬在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門(mén)監(jiān)督下就近掩埋處理，有相應(yīng)的生豬保險(xiǎn)理賠記錄。剩余存欄生豬 336 頭，臨床未見(jiàn)異常。據(jù)了解，死亡豬多為 100 kg 的大豬。p72 基因片段遺傳進(jìn)化分析顯示，本次暴發(fā)流行的毒株為基因 II 型，與俄羅斯及東歐流行的毒株屬同一分支，提示疫情可能來(lái)自俄羅斯和東歐疫情國(guó)家。為進(jìn)一步確定病毒與俄羅斯和東歐流行株的差異，正在對(duì)全基因組序列進(jìn)行分析。值得注意的是，該起疫情的病死率雖然很高（100%），但發(fā)病率和死亡率較低，發(fā)病高峰期 10 頭左右，平常日均死亡 3 頭左右。此外，同群豬臨床健康，隨機(jī)采集 30 頭豬的抗凝血、血清樣品的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果和血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，提示該起疫情毒株的群內(nèi)傳播能力或有一定局限性。

感染生豬及其產(chǎn)品的移動(dòng)是導(dǎo)致疫情快速遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。尤其值得注意的是，ASFV 在未經(jīng)高溫處理的肉品中存活能力很強(qiáng)，未經(jīng)高溫處理的泔水、煙熏肉、風(fēng)干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨區(qū)域傳播的重要因素。歷史上，多起跨境傳播的 ASF 疫情與航空器、列車(chē)運(yùn)載上述豬肉制品的處理不當(dāng)、感染ASF 野豬移動(dòng)有關(guān)[10]。目前， 應(yīng)加強(qiáng)流行病學(xué)調(diào)查和主動(dòng)監(jiān)測(cè)排查工作，特別對(duì)病死豬的檢測(cè)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注屠宰場(chǎng)、病死生豬無(wú)害化處理場(chǎng)等高風(fēng)險(xiǎn)場(chǎng)點(diǎn)，對(duì)已發(fā)現(xiàn)的確診病例要做進(jìn)一步追溯排查；加大科普宣傳，發(fā)動(dòng)養(yǎng)豬戶(hù)、診療人員和相關(guān)從業(yè)人員主動(dòng)上報(bào)可疑情況。若發(fā)生疫情，應(yīng)嚴(yán)格按照《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》和《非洲豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行處置。

致謝：

中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心王志亮總獸醫(yī)師在疫情調(diào)查和檢測(cè)分析過(guò)程中給予悉心指導(dǎo)，遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心積極協(xié)助調(diào)查并提供樣品。

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